Флороценоз

Подпишитесь
на новости ИЛС

Ваш e-mail:


(бесплатно для звонков по РФ) 8 (800) 100-28-84
+7 (495) 664-28-84

Региональные представители

О КОМПАНИИ НОВОСТИ МЕРОПРИЯТИЯ ЗАКАЗ ON-LINE ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ ВАКАНСИИ КОНТАКТЫ

Нормативные документы, методические пособия и рекомендации

Исследование клинического материала на наличие ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией


Организация: ФГУН ЦНИИ Эпидемиологии Роспотребнадзора
Дата утверждения: 22.04.2010

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО НАДЗОРУ В СФЕРЕ ЗАЩИТЫ ПРАВ ПОТРЕБИТЕЛЕЙ И БЛАГОПОЛУЧИЯ ЧЕЛОВЕКА

ФГУН ЦЕНТРАЛЬНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ

 

 

 

Методические рекомендации

 

 

 

Исследование клинического материала
на наличие ДНК возбудителей ИППП и других
инфекций органов репродукции методом ПЦР
с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

 

ОГЛАВЛЕНИЕ

Cписок сокращений
Принцип метода
Меры предосторожности
Дополнительные материалы и оборудование
Проведение ПЦР-исследования
Экстракция днк из исследуемых образцов
А. экстракция днк с использованием комплекта реагентов «ДНК-СОРБ-АМ»
Б. экстракция днк с использованием комплекта реагентов «ДНК-СОРБ-B»
Проведение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией, анализ и интерпретация результатов
Проведение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией по «конечной точке» - вариант FEP
Проведение реакции амплификации
Флуоресцентная детекция продуктов амплификации по «конечной точке»
Интерпретация результатов
Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании различных ПЦР-детекторов
Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании прибора «АЛА-1/4»
Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании приборов «ДЖИН» или «ДЖИН-4»
Проведение флуоресцентной детекции и интерпретация результатов при использовании приборов «Rotor-Gene» 6000 или «Rotor-Gene Q»
Проведение ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» - вариант FRT
Проведение амплификации c детекцией в режиме «реального времени»
Анализ и интерпретация результатов
Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» с использованием различных приборов
Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «Rotor-Gene» 3000 или 6000 или «Rotor-Gene Q»
Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «IQ iCycler» или «IQ5»
Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании прибора «ДТ-96»
Проведение ПЦР с детекцией в режиме «реального времени» при использовании приборов «MX3000P» или «MX3005P»

 

Перечень наборов реагентов «АмплиСенс®» производства ФГУН ЦНИИЭ
для выявления ДНК возбудителей ИППП и других инфекций органов репродукции методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

 

Выявляемые микроорганизмы (возбудители инфекций)

Наборы реагентов

Бактериальные инфекции

Chlamydia trachomatis

«АмплиСенс® Chlamydia trachomatis-FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Neisseria gonorrhoeae

«АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-скрин-FL»
«АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-тест-FL»
«АмплиСенс® Neisseria gonorrhoeae-FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Treponema pallidum

«АмплиСенс® Treponema pallidum-FL»

Mycoplasma genitalium

«АмплиСенс® Mycoplasma genitalium -FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Ureaplasma parvum, Ureaplasma urealyticum

«АмплиСенс® Ureaplasma spp.-FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Mycoplasma hominis

«АмплиСенс® Mycoplasma hominis -FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Gardnerella vaginalis

«АмплиСенс® Gardnerella vaginalis -FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Вирусные инфекции – герпесвирусы

HSV I, II

«АмплиСенс® HSV I , II-FL»
«АмплиСенс® HSV- typing-FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

CMV

«АмплиСенс® CMV -FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Протозойные инфекции

Trichomonas vaginalis

«АмплиСенс® Trichomonas vaginalis -FL»
Наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Грибковые инфекции

Candida albicans

«АмплиСенс® Candida albicans -FL»

Candida albicans,
Candida glabrata,
Candida krusei

 

Набор серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

 


Одновременно выявляемые микроорганизмы

Наборы реагентов серии «МУЛЬТИПРАЙМ»

Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp. /
Mycoplasma genitalium

«АмплиСенс® C. trachomatis / Ureaplasma /
M. genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Chlamydia trachomatis /
Ureaplasma spp./
Mycoplasma hominis

«АмплиСенс® C. trachomatis / Ureaplasma /
M. hominis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Neisseria gonorrhoeae /
Chlamydia trachomatis /
Mycoplasma genitalium /
Trichomonas vaginalis

 

«АмплиСенс® N.gonorrhoeae / C.trachomatis / M.genitalium / T.vaginalis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Chlamydia trachomatis / Ureaplasma spp. /
Mycoplasma genitalium /

Mycoplasma hominis

«АмплиСенс® C.trachomatis / Ureaplasma /M.genitalium / M.hominis-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Neisseria gonorrhoeae /
Chlamydia trachomatis /
Mycoplasma genitalium /

АмплиСенс® N.gonorrhoeae / C.trachomatis / M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

HSV I / HSV II

«АмплиСенс® HSV-typing -FL»

Ureaplasma parvum / Ureaplasma urealyticum

«АмплиСенс® U.parvum / U.urealyticum-FL»
(выявление и дифференциация)

Trichomonas vaginalis /
Neisseria gonorrhoeae

«АмплиСенс® T.vaginalis / N.gonorrhoeae -МУЛЬТИПРАЙМ-FL»

Chlamydia trachomatis /
Ureaplasma spp.

АмплиСенс® C.trachomatis / Ureaplasma -МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (FEP)

Chlamydia trachomatis /
Mycoplasma genitalium

АмплиСенс® C.trachomatis / M.genitalium-МУЛЬТИПРАЙМ-FL» (FEP)

Candida albicans /
Candida glabrata /
Candida krusei /

 

«АмплиСенс® C.albicans / C.glabrata / C.krusei-FL»

HSV / CMV

«АмплиСенс® HSV / CMV-FL»

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

В настоящих методических рекомендациях применяются следующие сокращения и обозначения:

ВКО-FL

- внутренний контрольный образец для наборов с гибридизационно-флуоресцентной детекцией

ИППП

- инфекции, передаваемые половым путем

ОКО

- отрицательный контрольный образец

ПКО

- положительный контрольный образец

ПЦР

- полимеразная цепная реакция

ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора

- Федеральное государственное учреждение науки «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

FEP

- флуоресцентная детекция по «конечной точке»

FRT

- флуоресцентная детекция в режиме «реального времени»

МУЛЬТИПРАЙМ

- серия наборов для одновременного выявления ДНК нескольких микроорганизмов в одной ПЦР

ПРИНЦИП МЕТОДА

Выявление микроорганизмов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флуоресцентной детекцией включает в себя три этапа: экстракцию (выделение) ДНК из образцов клинического материала, амплификацию фрагмента ДНК данного микроорганизма и гибридизационно-флуоресцентную детекцию, которая производится либо непосредственно в ходе ПЦР (вариант FRT), либо после ее завершения (вариант FEP). Экстракция ДНК из клинического материала проводится в присутствии внутреннего контрольного образца (ВКО-FL), который позволяет контролировать выполнение процедуры исследования для каждого образца. Затем с полученными пробами ДНК проводится реакция амплификации фрагмента ДНК выявляемого микроорганизма при помощи специфичных к нему праймеров и фермента Taq-полимеразы. В составе реакционной смеси присутствуют флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды, которые гибридизуются с комплементарным участком амплифицируемой ДНК-мишени, в результате чего происходит нарастание интенсивности флуоресценции. К олигонуклеотидным зондам, специфичным к различным ДНК-мишеням, прикреплены различные флуоресцентные метки. Это позволяет регистрировать накопление специфического продукта амплификации каждой ДНК-мишени путем измерения интенсивности флуоресцентного сигнала по соответствующему каналу.
Детекция флуоресцентного сигнала при использовании варианта FEP осуществляется после окончания ПЦР с помощью флуоресцентного ПЦР-детектора, а при использовании варианта FRT – непосредственно в ходе ПЦР с помощью амплификатора с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени». В обоих случаях детекция результатов ПЦР осуществляется без извлечения продуктов реакции из пробирок, что позволяет свести к минимуму риск контаминации продуктами ПЦР. Дополнительным преимуществом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией является возможность автоматизировать учет результатов анализа, снизить субъективизм в интерпретации результатов.
Преимуществом ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией являются также широкие возможности проведения мультиплексного ПЦР-анализа, т.е. одновременное проведение амплификации и детекции нескольких ДНК-мишеней (ДНК нескольких микроорганизмов) с помощью одной реакции. При этом благодаря проведенной оптимизации сохраняется высокая чувствительность в отношении каждой из выявляемых ДНК-мишеней. Использование мультиплексной ПЦР позволяет повысить производительность выполнения анализа в три-четыре раза без увеличения приборной базы лаборатории.
Для мультиплексного ПЦР-анализа с гибридизационно-флуоресцентной детекцией предназначены наборы серии «МУЛЬТИПРАЙМ».

МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

Работа должна проводиться в лаборатории, выполняющей молекулярно-биологические (ПЦР) исследования клинического материала на наличие возбудителей инфекционных болезней, с соблюдением санитарно-эпидемических правил СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений» и методических указаний МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот, при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I – IV групп патогенности».
Исследование разделяется на три этапа и проводится в трех помещениях (ЗОНАХ):
В ЗОНЕ 1 проводится первичный разбор, регистрация поступивших проб в рабочий журнал и предварительная обработка клинического материала.
В ЗОНЕ 2 проводится экстракция ДНК из клинического материала.
В ЗОНЕ 3 проводится подготовка пробирок для проведения ПЦР и проведение ПЦР и гибридизационно-флуоресцентной детекции.

При работе всегда следует выполнять следующие требования:

  • Использовать наконечники с фильтрами для автоматических дозаторов. Для каждой процедуры использовать новый наконечник.
  • Следует рассматривать образцы как потенциально вызывающие инфекцию и хранить в биологическом кабинете в соответствии с СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
  • Убирать и дезинфицировать разлитые образцы или реактивы, используя дезинфицирующие средства в соответствии СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III – IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
  • Уничтожать образцы и неиспользованные реактивы в соответствии с требованиями СП 2.1.7.728-99 «Правила сбора, хранения и удаления отходов лечебно-профилактических учреждений».

ВНИМАНИЕ! При утилизации пробирок, содержащих продукты ПЦР после амплификации, недопустимо их открывание и разбрызгивание содержимого, поскольку это может привести к контаминации продуктами амплификации лабораторной зоны, оборудования и реагентов.
Интерпретация результатов и внесение готовых результатов в журнал проводит аккредитованный врач-лаборант.
Результаты ПЦР-исследования учитываются в комплексной диагностике заболевания.

ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

Для взятия клинического материала:
Транспортная среда - «Транспортная среда с муколитиком (ТСМ)» (ТУ 9398-098-01897593-2009) или «Транспортная среда для мазков» (ТУ 9398-088-01897593-2009), или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора (при работе с формами комплектации 1–3).
Для предобработки клинического материала и проведения экстракции ДНК из клинических образцов (ЗОНЫ 1-2):

  • Комплект реагентов для выделения ДНК - «ДНК-сорб-АМ» (ТУ 9398-036-01897593-2009) или другие рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
  • Бокс биологической безопасности (бокс абактериальной воздушной среды)
    2 класса защиты (например, «БАВп-01-«Ламинар-С»-1,2», «Ламинарные системы», Россия).
  • Термостат для пробирок типа «Эппендорф» от 25 до 100 °С (например, «ТЕРМО 24-15», «Биоком», Россия).
  • Микроцентрифуга для пробирок типа «Эппендорф» до 16 тыс об/мин (например, «MiniSpin», «Eppendorf», Германия).
  • Вортекс (например, «ТЭТА-2», «Биоком», Россия).
  • Отдельный набор автоматических дозаторов переменного объема (например, «Ленпипет», Россия).
  • Вакуумный отсасыватель медицинский с колбой-ловушкой для удаления надосадочной жидкости (например, «ОМ-1», г. Ульяновск, Россия).
  • Одноразовые полипропиленовые завинчивающиеся или плотно закрывающиеся микропробирки на 1,5 мл (например, «Axygen», США).
  • Штативы для микропробирок на 1,5 мл (например, «ИнтерЛабСервис», Россия) и наконечников (например, «Axygen», США).
  • Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема с аэрозольным барьером до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
  • Одноразовые наконечники для дозаторов переменного объема до 200 мкл и до 1000 мкл (например, «Axygen», США).
  • Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С.
  • Отдельный халат и одноразовые перчатки.
  • Емкость с дезинфицирующим раствором.
  • Одноразовые пластиковые контейнеры для сброса и инактивации материалов.

Для проведения амплификации и флуоресцентной детекции (ЗОНА 3):

  • Бокс абактериальной воздушной среды (ПЦР-бокс).
  • Центрифуга/вортекс.
  • Автоматические дозаторы переменного объема (от 5 до 20 мкл, при работе с «ПЦР-комплект» вариант FRT-100 F – от 5 до 20 мкл и от 20 до 200 мкл).
  • Одноразовые наконечники с фильтром до 100 мкл в штативах.
  • Штативы для микропробирок объемом 0,2 мл или 0,5 мл (в соответствии с используемыми комплектами реагентов). Холодильник от 2 до 8 °С с морозильной камерой не выше минус 16 °С для выделенных проб ДНК.
  • Отдельный халат, шапочки, обувь и одноразовые перчатки по МУ 1.3.1888-04.
  • Емкость для сброса наконечников.

При работе с «ПЦР-комплектом» вариант FEP:

  • Программируемый амплификатор (например, «Терцик» («ДНК-Технология», Россия), «Gradient Palm Cycler» («Corbett Research», Австралия), «MAXYGENE» («Axygen», США), «GeneAmp PCR System 2700» («Applied Biosystems») или аналогичные).
  • Флуоресцентный ПЦР-детектор (например, «AЛА-1/4» («BioSan», Латвия), «Джин» («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
  • Пластиковая пипетка для минерального масла (для работы с «ПЦР-комплектом» вариант FEP-1000).

При работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT:
8. Программируемый амплификатор с системой детекции флуоресцентного сигнала в режиме «реального времени» – при работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT (например, «Rotor-Gene» 3000/6000 («Corbett Research», Австралия), «Rotor-Gene Q» («Qiagen», Германия), «iQ5» («Bio-Rad», США), «Mx3000P» («Stratagene», США), «ДТ-96» («ДНК-Технология», Россия) или аналогичные).
9. Одноразовые полипропиленовые микропробирки для ПЦР объемом 0,2 мл или 0,1 мл – при работе с «ПЦР-комплектом» вариант FRT-100 F:
а) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с выпуклой крышкой (например, «Axygen», США) – при использовании прибора планшетного типа;
б) тонкостенные пробирки для ПЦР объемом 0,2 мл с плоской крышкой (например, «Axygen», США), или пробирки для ПЦР к «Rotor-Gene», объемом 0,1 мл в стрипах по 4 шт. с крышками (например, «Corbett Research», Австралия; «Qiagen», Германия) – при использовании прибора роторного типа.


ВЗЯТИЕ, ТРАНСПОРТИРОВАНИЕ И ХРАНЕНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА

Перед началом работы следует ознакомиться с методическими рекомендациями «Взятие, транспортировка, хранение клинического материала для ПЦР-диагностики», разработанными ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, Москва, 2008 г.
Материалом для исследования служат: соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, прямой кишки, ротоглотки; отделяемое конъюнктивы глаз, эрозивно-язвенных элементов слизистых и кожи; моча (первая порция мочи), секрет предстательной железы человека.

Для проведения анализа, как правило, используются следующие виды клинического материала:

  • У женщин: соскобное отделяемое слизистых оболочек цервикального канала, влагалища, уретры; моча.
  • У мужчин: соскобное отделяемое слизистой оболочки уретры, моча, секрет предстательной железы.
  • У детей: моча, отделяемое конъюнктивы глаз.

Взятие клинического материала должно производиться в пробирки с транспортной средой, рекомендованной ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.
Полученные образцы (кроме образцов мочи) можно транспортировать и хранить в следующих режимах:

  • при комнатной температуре – в течение 48 часов;
  • при температуре от 2 до 8 °С – в течение двух недель;
  • при температуре не выше мину 20 °С – в течение месяца;
  • при температуре не выше минус 68 °С – длительно.

Полученные образцы, помещенные в транспортную среду с муколитиком (ТСМ), можно транспортировать и хранить:

  • при комнатной температуре (от 18 до 25 °С) до 28 суток;
  • при температуре от 2 до 8 °С до 3 месяцев;
  • при температуре не выше минус 20 °С – длительно.

Допускается однократное замораживание-оттаивание клинических образцов.
Полученные образцы мочи можно транспортировать и хранить:

  • при комнатной температуре – в течение 6 часов;
  • при температуре от 2 до 8 °С – в течение суток;

Доставка клинических образцов осуществляется в специальном контейнере с охлаждающими элементами.
Для проведения исследования на наличие ДНК определенного микроорганизма анализируются следующие виды клинического материала:
- для выявления ДНК Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Mycoplasma genitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasma spp.,U.parvum / U.urealyticum, Mycoplasma hominis–соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, образцы мочи, секрет предстательной железы человека.
- для выявления ДНК Chlamydia trachomatisи Neisseria gonorrhoeae возможно также исследовать отделяемое конъюнктивы глаз, соскобное отделяемое слизистых оболочек прямой кишки, ротоглотки.

  • для выявления ДНК HSVI и II типов, Treponema pallidum– соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, прямой кишки, ротовой полости, отделяемое везикул (пузырьковых высыпаний) и эрозивно-язвенных поражений кожи и слизистых оболочек.
  • для выявления ДНК HSVI и II типов можно также исследовать цельную кровь и ликвор, отделяемое конъюнктивы глаз.
  • для выявления ДНК CMV – соскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, моча, слюна и цельная кровь.
  • для выявления ДНКCandida albicansсоскобное отделяемое слизистых оболочек урогенитального тракта, ротовой полости; моча.
  • для выявления ДНКGardnerella vaginalisсоскобное отделяемое слизистой оболочки влагалища.

При использовании секрета предстательной железы, цельной крови или ликвора для экстракции ДНК рекомендуется использовать комплект реагентов «ДНК-сорб-B».

ПРОВЕДЕНИЕ ПЦР-ИССЛЕДОВАНИЯ

ПЦР-исследование состоит из следующих этапов:

  • Экстракция (выделение) ДНК из исследуемых (клинических) образцов;
  • Проведение амплификации (вариант FEP) или амплификации с детекцией в режиме «реального времени» (вариант FRT) *.
  • Флуоресцентная детекция продуктов амплификации (вариант FEP).
  • Анализ и интерпретация результатов.

*) При использовании ПЦР-комплектов вариант FRT проводят ПЦР с детекцией в режиме «реального времени», т.е. совмещают этапы амплификации и детекции продуктов амплификации. При использовании ПЦР-комплектов вариант FEP флуоресцентная детекция проводится отдельным этапом после завершения амплификации («по конечной точке»).

ЭКСТРАКЦИЯ ДНК ИЗ ИССЛЕДУЕМЫХ ОБРАЗЦОВ

Для экстракции (выделения) ДНК используются наборы реагентов, рекомендованные ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора, в соответствии с инструкцией к используемому набору. Экстракция ДНК из каждого клинического образца проводится в присутствии внутреннего контрольного образца – ВКО-FL.
При использовании набора реагентов, включающего комплект «ДНК-сорб-АМ», для экстракции ДНК используется входящий в набор комплект «ДНК-сорб-АМ» (за исключением экстракции из образцов клинического материала, для которого рекомендуется использовать комплект «ДНК-сорб-B»).

Предварительная обработка образцов клинического материала
(требуется только для образцов мочи)

Взболтать флакон с мочой. Перенести 1 мл мочи в стерильную одноразовую пробирку объемом 1,5 мл, используя отдельный наконечник с фильтром для каждого образца. Центрифугировать 5 мин при 10000 g (12 тыс об/мин на центрифуге «MiniSpin», Eppendorf). При наличии большого количества солей ресуспендировать только верхний слой осадка солей в объеме 1 мл и затем снова центрифугировать. Используя вакуумный отсасыватель с колбой-ловушкой, полностью удалить надосадочную жидкость, не захватывая осадок и используя для каждого образца отдельный наконечник (без фильтра). К осадку добавить транспортную среду до конечного объема 0,2 мл. Тщательно перемешать содержимое пробирки на вортексе.
Предварительно обработанные образцы мочи (осадок мочи в транспортной среде) можно хранить

  • при температуре от 2 до 8 °С – в течение суток;
  • при температуре не выше минус 20 °С – в течение недели;
  • при температуре не выше минус 68 °С – длительно.

А. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-АМ»

Принцип метода экстракции
Клинический образец (клинический материал, помещенный в транспортную среду) обрабатывается лизирующим раствором в присутствии частиц силики – сорбента. В результате происходит деструкция клеточных мембран, вирусных оболочек и других биополимерных комплексов и высвобождение ДНК. Растворенная ДНК в присутствии лизирующего раствора связывается с частицами сорбента, в то время как другие компоненты лизированного клинического материала остаются в растворе и удаляются при осаждении сорбента центрифугированием и последующей отмывкой. При добавлении раствора для элюции ДНК к сорбенту происходит переход ДНК с поверхности силики в раствор, который отделяется от частичек сорбента центрифугированием. В результате указанной процедуры получается высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, что обеспечивает высокую аналитическую чувствительность ПЦР-исследования.

Состав комплекта «ДНК-сорб-АМ»


Реагент

Описание

Вариант 50

Вариант 100

Объем (мл)

Кол-во

Объем (мл)

Кол-во

Лизирующий раствор

Раствор, содержащий хаотропный агент

15

1 флакон

30

1 флакон

Отмывочный раствор

Раствор, содержащий этиловый спирт

50

1 флакон

100

1 флакон

Сорбент универсальный

Суспензия частиц силики

1,0

1 пробирка

1,0

2 пробирки

ТЕ-буфер
для элюции ДНК

Буферный раствор для элюции ДНК

5,0

1 пробирка

5,0

2 пробирки

Дополнительно к комплекту реагентов прилагаются следующие реагенты:


Реагент

Описание

Вариант 50

Вариант 100

Объем (мл)

Кол-во

Объем (мл)

Кол-во

ВКО комплексный

Раствор, содержащий фрагменты ДНК ВКО
(в составе генно-инженерных конструкций)

1,0

1 пробирка

1,0

1 пробирка

ВКО-FL

Раствор, содержащий фрагмент ДНК ВКО-FL
(в составе генно-инженерных конструкций)

1,0

1 пробирка

1,0

1 пробирка

ОКО

Транспортная среда

1,2

1 пробирка

1,2

1 пробирка

Подготовка к проведению экстракции ДНК

  • Включить термостат и установить температуру 65 °С.
  • Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) следует прогреть, перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов (кристаллы могут образовываться на дне флакона).
  • Подготовить и расставить в штативе необходимое количество одноразовых стерильных полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл, промаркировать их.
  • Подготовить и расставить в штативе пробирки с клиническими образцами. Перед проведением процедуры экстракции нуклеиновых кислот осадить капли материала со стенок пробирки и внутренней части крышки центрифугированием (1500-3000 об/мин в течение 5 с), после чего аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе, избегая разбрызгивания и попадания материала на внутреннюю часть крышки.
  • При использовании первой порции мочи для исследования образцов провести предварительную обработку с целью получения образцов осадка мочи в транспортной среде, как описано в разделе выше.

 

Процедура экстракции ДНК

  • В подготовленные одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки внести по 10 мкл ВКО-комплексного или ВКО-FL в зависимости от метода детекции продуктов ПЦР (см. «Состав комплекта»). При использовании наборов реагентов с разными методами детекции допускается внесение двух препаратов внутреннего контрольного образца по 10 мкл каждого.
  • Ресуспендировать сорбент и внести в каждую пробирку по 20 мкл сорбента универсального, после чего внести по 300 мкл лизирующего раствора, используя наконечники с аэрозольным барьером.

Примечание. Если количество обрабатываемых клинических образцов составляет более 50 за рабочую смену, рекомендуется добавить весь объем сорбента и ВКО во флакон с лизирующим раствором (2 мл сорбента универсального и 1 мл ВКО на 30 мл лизирующего раствора). Полученную суспензию тщательно перемешать и внести по 330 мкл в подготовленные пробирки. Допускается хранение смеси не более 2 сут при комнатной температуре. Перед применением суспензию тщательно перемешать.

  • Внести по 100 мкл клинического образца, используя для каждой пробы отдельный наконечник с фильтром. В пробирку отрицательного контроля выделения внести 100 мкл ОКО.
  • Пробирки плотно закрыть, содержимое тщательно перемешать на вортексе и инкубировать 5 мин при 65 °С в термостате. После окончания инкубации содержимое повторно перемешать на вортексе и оставить при комнатной температуре на 2 мин.
  • Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 10 тыс об/мин в течение 30 с. Не захватывая сорбент, удалить надосадочную жидкость в колбу-ловушку с помощью вакуумного отсасывателя, используя для каждой пробы отдельный наконечник без фильтра.
  • Добавить в пробы по 1 мл отмывочного раствора, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента.
  • Повторить п. 5.
  • Поместить пробирки в термостат с температурой 65 °С на 5-10 мин для подсушивания сорбента, при этом крышки пробирок должны быть открыты.
  • В пробирки добавить по 100 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК, используя наконечник с фильтром. Перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента. Поместить в термостат с температурой 65 °С на 5 мин. Допускается при необходимости увеличение объема элюции до 150 мкл.
  • Центрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Полученные пробы ДНК можно хранить в течение 1 нед при температуре от 2 до 8 °С или в течение года при температуре не выше минус 16 °С.
При повторном исследовании проб, содержимое пробирок необходимо перемешать на вортексе и повторить центрифугирование в соответствии с п.10.

Б. Экстракция ДНК с использованием комплекта реагентов «ДНК-сорб-B»

Принцип метода экстракции
Принцип метода экстракции при использовании комплекта реагентов «ДНК-сорб-B» соответствует описанному выше для методики экстракции с использованием комплекта «ДНК-сорб-АМ».
Состав комплекта «ДНК-сорб-B»

Реагент

Описание

Вариант 50

Вариант 100

Объем (мл)

Кол-во

Объем (мл)

Кол-во

Лизирующий раствор

Раствор, содержащий хаотропный агент

15

1 флакон

30

1 флакон

Раствор для отмывки 1

Раствор, содержащий хаотропный агент и этиловый спирт

15

1 флакон

30

1 флакон

Раствор для отмывки 2

Раствор, содержащий этиловый спирт

50

1 флакон

100

1 флакон

Сорбент универсальный

Суспензия частиц силики

1,25

1 пробирка

1,25

2 пробирки

ТЕ-буфер
для элюции ДНК

Буферный раствор для элюции ДНК

5,0

1 пробирка

5,0

2 пробирки

Подготовка к проведению экстракции ДНК

  • Включить термостат и установить температуру 65 °С.

Лизирующий раствор (если он хранился при температуре от 2 до 8 °С) следует прогреть, перемешивая при температуре 65 °С до полного растворения кристаллов.

  • Подготовить и расставить в штативе необходимое количество одноразовых стерильных полипропиленовых пробирок объемом 1,5 мл и промаркировать их.
  • Подготовить и расставить в штативе пробирки с клиническими образцами. Перед проведением процедуры экстракции нуклеиновых кислот осадить капли материала со стенок пробирки и внутренней части крышки центрифугированием (1500-3000 об/мин в течение 5 с), после чего аккуратно перемешать содержимое пробирки на вортексе, избегая разбрызгивания и попадания материала на внутреннюю часть крышки.

Процедура экстракции ДНК

  • В подготовленные одноразовые стерильные полипропиленовые пробирки внести по 10 мкл ВКО-комплексного или ВКО-FL в зависимости от метода детекции продуктов ПЦР. При использовании наборов реагентов с разными методами детекции допускается внесение двух препаратов внутреннего контрольного образца по 10 мкл каждого.
  • В каждую из подготовленных пробирок внести по 300 мкл лизирующего раствора.
  • В пробирки с лизирующим раствором и ВКО внести по 100 мкл клинического образца, используя наконечники с фильтром. В пробирку отрицательного контроля (ОК) выделения внести 100 мкл ОКО.
  • Содержимое пробирок тщательно перемешать на вортексе, затем инкубировать 5 мин при температуре 65 °С. Центрифугировать 5 с при 5 тыс об/мин на микроцентрифуге. Если проба растворилась не полностью, центрифугировать пробирку на микроцентрифуге 5 мин при 12 тыс об/мин и использовать для выделения ДНК надосадочную жидкость, перенеся ее в новую пробирку.
  • Тщательно ресуспендировать сорбент универсальный на вортексе. В каждую пробирку отдельным наконечником добавить по 25 мкл ресуспендированного сорбента универсального. Перемешать на вортексе, поставить в штатив на 2 мин, еще раз перемешать и оставить в штативе на 5 мин.
  • Осадить сорбент в пробирках центрифугированием при 5 тыс об/мин в течение 30 с. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
  • Добавить в пробирки по 300 мкл раствора для отмывки 1, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального.
  • Повторить п. 6.
  • Добавить в пробирки по 500 мкл раствора для отмывки 2, перемешать на вортексе до полного ресуспендирования сорбента универсального.
  • Осадить сорбент центрифугированием при 10 тыс об/мин в течение
    30 с на микроцентрифуге. Удалить надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы.
  • Повторить процедуру отмывки, следуя пп. 9-10, удалить надосадочную жидкость полностью.
  • Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5-10 мин. При этом крышки пробирок должны быть открыты.
  • В пробирки внести по 50 мкл ТЕ-буфера для элюции ДНК. Перемешать содержимое пробирок на вортексе. Поместить пробирки в термостат при температуре 65 °С на 5 мин, периодически встряхивая на вортексе.
  • Центрифугировать пробирки при 12 тыс об/мин в течение 1 мин на микроцентрифуге. Надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК. Пробы готовы к постановке ПЦР.

Полученные пробы ДНК можно хранить в течение 1 недели при температуре от 2 до 8 °С и в течение года при температуре не выше минус 16 °С.


ВКонтакт Facebook Google Plus Одноклассники Twitter Livejournal Liveinternet Mail.Ru


Назад к списку статей