Молекулярная диагностика-2017

Флороценоз

Подпишитесь
на новости ИЛС

Ваш e-mail:


(бесплатно для звонков по РФ) 8 (800) 100-28-84
+7 (495) 664-28-84

Региональные представители

О КОМПАНИИ НОВОСТИ МЕРОПРИЯТИЯ ЗАКАЗ ON-LINE ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ ВАКАНСИИ КОНТАКТЫ

Пиросеквенирование: сочетание секвенирования и количественного анализа

Пиромарки

Пиросеквенирование — это метод секвенирования ДНК (определение последовательности нуклеотидов в молекуле ДНК), основанный на принципе «секвенирование путем синтеза». 

Метод «секвенирования путем синтеза» позволяет секвенировать одну цепь ДНК путем синтеза комплементарной цепи, при этом регистрируется присоединение каждого нуклеотида. В ходе реакции матрица ДНК иммобилизована, растворы нуклеотидов A, C, G и T добавляются и отмываются последовательно после каждого цикла секвенирования. 


Метод пиросеквенирования основан на детекции активности фермента ДНК-полимеразы с другим хемилюминесцентным ферментом. Последовательность подачи реагентов в реакционную смесь, которые дают хемилюминесцентный сигнал, позволяет определить последовательность анализируемого участка ДНК.

Последовательность реакций пиросеквенирования

В реакции пиросеквенирования участвуют четыре фермента. Схема и основные этапы реакции представлены на рис. 1. 

Схема реакции пиросеквенирования.jpg

    Рисунок 1. Схема реакции пиросеквенирования.

Пиросеквенирование включает в себя следующие этапы:

Этап 1

Амплификация фрагмента ДНК и биотинилирование цепи, которая послужит матрицей для пиросеквенирования. Денатурация биотинилированного одноцепочечного ПЦР-ампликона, его изоляция и гибридизация с праймером для секвенирования.

Этап 2

Инкубация праймера и одноцепочечной матрицы в присутствии ДНК-полимеразы, АТФ-сульфурилазы, люциферазы, апиразы, и субстратов: аденозин - 5’- фосфосульфата (APS) и люциферина.

Этап 3

Добавление первого дезоксирибонуклеотид трифосфата (dNTP) в реакцию. ДНК-полимераза катализирует добавление dNTP к праймеру для секвенирования, если он комплементарен к последовательности матрицы ДНК. Каждое присоединение к цепи сопровождается выделением пирофосфата (PPi) в количестве, эквимолярном количеству встроившихся нуклеотидов.

Этап 4

АТФ-сульфурилаза превращает пирофосфат в АТФ в присутствии аденозин-5’-фосфосульфата. Образовавшаяся АТФ запускает люциферазо-опосредованную реакцию окисления люциферина в оксилюциферин, в результате чего происходит образование видимого света в количестве, пропорциональном количеству АТФ. Свет детектируется CCD-камерой и отображается на пирограмме в виде пиков. Высота пиков пропорциональна количеству нуклеотидов, встроившихся в матрицу.

Этап 5

В течение всей реакции фермент апираза деградирует невстроившиеся нуклеотиды и избыток АТФ. После завершения деградации нуклеотидов, не встроившихся в цепь ДНК, добавляется новый нуклеотид.

Этап 6

Добавление нуклеотидов осуществляется последовательно. Следует отметить, что дезоксиаденозин-альфа-тио-фосфат используется в роли заместителя дезоксиаденозин-3-фосфата (дАТФ), так как он эффективно распознается ДНК-полимеразой, но не распознается люциферазой. В течение реакции комплементарная цепь ДНК достраивается, и последовательность нуклеотидов определяется согласно пикам на пирограмме.

Пиросеквенаторы PyroMark (QIAGEN)

Объединяя секвенирование и количественную оценку генетических изменений в одной мощной системе, приборы серии PyroMark превосходят все другие системы секвенирования при целевом анализе небольших фрагментов ДНК. Это, в свою очередь, приводит к уменьшению временных и денежных вложений при использовании PyroMark в разнообразных областях применения.

Отличительные преимущества пиросеквенирования PyroMark:

  • Секвенирование de novo коротких фрагментов ДНК (до 180 п.о.)
  • Ресеквенирование любого участка генома человека, модельных объектов, микроорганизмов или вирусов
  • Количественный анализ частот аллельной встречаемости
  • Мутационный анализ: идентификация точечных однонуклеотидных замен, вставок и делеций
  • Количественный анализ метилирования ДНК. Анализ метилирования может быть совмещен с SNP типированием
  • Верификация и валидация результатов полногеномного анализа

На сегодняшний день линейка секвенаторов PyroMark представлена следующими моделями:

Система секвенирования

PyroMark Q24

PyroMark Q24

PyroMark Q24

PyroMark Q24 Advanced

PyroMark Q96 ID

Qiagen PyroMark Q96 ID

PyroMark Q96 MD

PyroMark Q96 MD

PyroMark Q48 Autoprep

PyroMark Q24

PyroMark Q24 Advanced

PyroMark Q96 ID

PyroMark Q96 MD

PyroMark Q48 Autoprep

Описание

Секвенатор для лабораторной диагностики

Модернизированная модель PyroMark Q24

Секвенатор с высокой пропускной способностью

Секвенатор с интегрированным самоукладчиком микропланшет

Секвенатор с полной автоматизацией пробоподготовки

Длина чтения ДНК

до 80 п.о.

до 180 п.о.

до 80 п.о.

до 80 п.о.

до 180 п.о.

Количество образцов/запуск

24

24

96

96

48

Наличие регистрационного удостоверения

Наличие

ФСЗ 2010/08544 от 3.12.2010 г.

Отсутствует

Отсутствует

Отсутствует

Отсутствует


Области применения пиросеквенирования

Генетическое тестирование

Онкология

Микробиология и генная инженерия

  • Генотипирование штаммов.
  • Ресеквенирование генов: обнаружение новых генетических вариантов, островков патогенности, вирулентности и т.д.
  • Идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость вирусов к антиретровирусной терапии.
  • Идентификация мутаций, обуславливающих устойчивость бактерий и грибов к антибиотикам.
  • Проверка результатов клонирования: секвенирование ПЦР-ампликонов, плазмид, ДНК-кассет.
  • Разработка уникальных ПЦР тест-систем.

Дополнительная информация:

PyroMark Q24

PyroMark Q24 Advanced

PyroMark Q48 Autoprep


Скачать  Скачать брошюру QIAGEN о технологии пиросеквенирования


Список использованной литературы

1. К.О. Миронов, Е.А. Дунаева, О.П. Дрибноходова, В.Г. Дедков, Г.А. Шипулин. Детекция генетических полиморфизмов с использованием системы генетического анализа на основе пиросеквенирования PyroMark Q24 // Справочник заведующего КДЛ. 2011. N 4. С. 39-48

2. К.О. Миронов, Е.А. Дунаева, О.П. Дрибноходова, Г.А. Шипулин. Детекция генетических полиморфизмов с помощью систем генетического анализа на основе пиросеквенирования // Современные медицинские технологии. 2011. С. 39-41

3. Dunker J., Larsson U., Petersson D. et al. Parallel DNA template preparation using a vacuum filtration sample transfer device // Biotechniques. 2003. Vol. 34, N 4. P. 862–866, 868.

4. King C.R., Scott-Horton T. Pyrosequencing: a simple method for accurate genotyping // Methods Mol. Biol. 2007. Vol. 373. P. 39–56.

5. Ronaghi M., Uhlen M., Nyren P. A sequencing method based on real-time pyrophosphate // Science. 1998. Vol. 17, N 281 (5375). P. 363–365.

6. Royo J.L., Galan J.J. Pyrosequencing for SNP genotyping // Methods Mol. Biol. 2009. Vol. 578. P. 123–133.

7. Tsiatis A.C., Norris-Kirby A., Rich R.G. et al. Comparison of Sanger sequencing, pyrosequencing, and melting curve analysis for the detection of KRAS mutations: diagnostic and clinical implications // J. Mol. Diagn. 2010. Vol. 12, N 4. P. 425–432.