Флороценоз

Подпишитесь
на новости ИЛС

Ваш e-mail:


(бесплатно для звонков по РФ) 8 (800) 100-28-84
+7 (495) 664-28-84

Региональные представители

О КОМПАНИИ НОВОСТИ МЕРОПРИЯТИЯ ЗАКАЗ ON-LINE ОБРАТНАЯ СВЯЗЬ ВАКАНСИИ КОНТАКТЫ

Новый метод выделения ДНК из парафиновых блоков и удаление артефактов секвенирования

Фиксация тканей формалином и длительное хранение образцов (парафиновые блоки, FFPE) при неблагоприятных условиях способствуют сильным повреждениям ДНК. Результатом этого может быть появление артефактов при секвенировании данных образцов. Транзиции цитозин-тимин составляют большинство таких артефактов (1, 2). Хотя точный механизм этого процесса неизвестен, одним из объяснений является тот факт, что дезаминирование цитозина приводит к формированию в этом положении урацила (Рис. 1). 

При секвенировании формируется пара с аденином (3) и это модифицированное основание читается как замена C>T. Если нить-специфическая информация ДНК не сохраняется во время создания библиотеки и комплементарная нить ДНК не может быть секвенирована, то артефакт может проявиться в виде замен C>T или G>A. Удаление таких артефактов в образцах особенно важно при поиске соматических мутаций в онкогенах, так как они в противном случае могут определяться как ложноположительные мутации.

Дезаминирование цитозина

Рисунок 1. Дезаминирование цитозина приводит к спариванию с аденином. В парафиновых блоках цитозин может дезаминироваться, что приводит к образованию урацила и образованию пары с аденином. В реакции секвенирования это будет проявляться как транзиции C>T или G>A.

Удаление ложноположительных вариантов

Для проверки работы нового набора было проведено сравнительное исследование. Образцы ДНК были выделены параллельно с использованием стандартного набора QIAamp DNA FFPE Tissue Kit и нового набора GeneRead DNA FFPE Kit. Выявление соматических мутаций было произведено с использованием технологии секвенирования нового поколения и панели для таргетного обогащения генов GeneRead DNAseq Comprehensive Cancer Panel (Рис. 2). 

Частота обнаруженных мутаций показана в двух последних столбцах. 4 мутации из 19, которые были обнаружены с использованием стандартного набора, не подтвердились с применением новой технологии GeneRead DNA FFPE Kit. Это были мутации с самой низкой частотой встречаемости и все из них являлись заменами C>T и G>A. Таким образом, эти замены являются артефактами фиксации образцов формалином и длительного хранения. Все другие мутации были найдены в обоих образцах с очень близкими значениями частот встречаемости, что указывает на то, что новый набор специфически удаляет артефактные транзиции, оставляя истинные мутации без изменений.

Анализ соматических мутаций

Рисунок 2. Анализ соматических мутаций материала карциномы печени, фиксированном в парафиновом блоке. Данный образец хранился в течение 15 лет.

Новая технология выделения и очистки ДНК из FFPE образцов

Компания QIAGEN существенно модифицировала нынешнюю технологию выделения и очистки ДНК из FFPE образцов. Новая технология была разработана для того, чтобы избавиться от артефактов секвенирования, возникших в результате фиксации образцов формалином и хранения, а также с целью оптимизации выхода очищенной ДНК из небольших количеств исходного материала.

Уникальные характеристики нового набора реагентов GeneRead DNA FFPE Kit:

  • Ферментативное удаление артефактов секвенирования, являющихся результатом фиксации и хранения образцов;
  • Высокий выход очищенной ДНК из малого количества клинического материала;
  • Применение эффективной и нетоксичной депарафинизации;
  • Возможность автоматизации процесса выделения ДНК с использованием станции QIAcube.

Ферментативное удаление артефактов секвенирования

Рисунок 3. Ферментативное удаление артефактов секвенирования с использованием урацил-ДНК-гликозилазы.

Набор реагентов GeneRead DNA FFPE Kit содержит в своем составе уникальный фермент урацил-ДНК-гликозилазу, который специфически отщепляет несвойственные последовательностям ДНК нуклеотидные основания урацила (Рис. 3). Готовый набор оптимизирует условия для точной и эффективной работы фермента с целью удаления артефактов секвенирования.

Обнаружение низкочастотных мутаций может быть очень важным, например, в анализе образцов при проведении онкологических исследований. Поэтому важно провести четкое различие между истинными и ложноположительными мутациями.

Удаление артефактов особенно актуально, когда секвенируются малые количества исходного материала, в котором относительная частота таких ложноположительных мутаций может быть увеличена.

Некоторые из обнаруженных в ходе анализа замен C>T или G>A могут не иметь клинической значимости. Однако из-за артефактов секвенирования большая часть этих мутаций может быть аннотирована с использованием баз данных, в частности dbSNP и COSMIC. По результатам такого анализа могут быть сделаны неверные выводы всего исследования.

Таким образом, новая технология GeneRead DNA FFPE Kit способна максимизировать выход очищенной ДНК из парафиновых блоков и, в тоже время, эффективно удалить артефакты секвенирования C> T и G>A.


Список литературы:

1. Williams, C., et al. (1999). A high frequency of sequence alterations is due to formalin fixation of archival specimens. American Journal of Pathology 155, 1467.

2. Yost, S.E., et al. (2012). Identification of high-confidence somatic mutations in whole genome sequence of formalin-fixed breast cancer specimens. Nucleic Acids Research 40:14, 1.

3. Do, H., Wong, S.Q., Li, J., Dobrovic, A., et al. (2013). Reducing sequence artifacts in amplicon-based massively parallel sequencing of formalin-fixed paraffin-embedded DNA by enzymatic depletion of uracil-containing templates. Clinical Chemistry 59:9, 18.

4. Kerick, M., et al. (2011). Targeted high throughput sequencing in clinical cancer settings: formaldehyde fixed-paraffin embedded (FFPE) tumor tissues, input amount and tumor heterogeneity. BMC Medical Genomics, 4, 68.


Дополнительная информация:

Скачать  Скачать постер QIAGEN о новой технологии GeneRead DNA FFPE Kit